Klindamycyna w hamowaniu progresji czerniaka naczyniówki – nowe odkrycie

Jak makrofagi wpływają na progresję czerniaka naczyniówki?

Czerniak naczyniówki (uveal melanoma, UM) to najczęstszy nowotwór złośliwy gałki ocznej u dorosłych, charakteryzujący się szczególnie złym rokowaniem po osiągnięciu stadium przerzutowego. Jednym z czynników promujących progresję UM są makrofagi związane z guzem (tumor-associated macrophages, TAMs), których obecność w mikrośrodowisku nowotworowym dodatnio koreluje z niekorzystnym rokowaniem i krótszym przeżyciem. Naukowcy postawili hipotezę, że immunomodulacja TAMs może przemodelować mikrośrodowisko guza i zwiększyć jego podatność na interwencje terapeutyczne. Niedawne odkrycia w gruczolakoraku przewodowym trzustki potwierdzają to założenie, pokazując, że IL-1β, kluczowa cząsteczka efektorowa uwalniana przez aktywowane makrofagi, napędza wzrost guza, a jej hamowanie łagodzi stan zapalny.

Badacze opracowali zintegrowany przepływ pracy obliczeniowej, który wykorzystuje dane transkryptomiczne, selekcję celów białkowych opartą na analizie sieci oraz modelowanie farmakoforów biblioteki leków zatwierdzonych przez FDA. Zastosowali tę metodologię do TAMs w UM jako studium przypadku i odkryli oraz eksperymentalnie zwalidowali nową, kontekstowo istotną interakcję między antybiotykiem klindamycyną a kaspazą-1. W przeprowadzonych eksperymentach interakcja ta hamuje wydzielanie prozapalnych cytokin, takich jak IL-1β z makrofagów, tym samym tłumiąc pyroptozę – prozapalną formę programowanej śmierci komórek immunologicznych.

Przepływ pracy został zaprojektowany do repozycjonowania leków, czyli ponownego wykorzystania zatwierdzonych leków w nowych kontekstach klinicznych. Repozycjonowanie leków wykorzystuje wcześniejszą wiedzę o biodystrybucji i progach toksyczności istniejących leków, aby skrócić czas od odkrycia do zatwierdzenia regulacyjnego. Tradycyjnie badania nad repozycjonowaniem leków były realizowane poprzez systematyczne badania przesiewowe in vitro. Korzystając z biologii obliczeniowej, można zarówno przyspieszyć ten proces, jak i odkryć nowe interakcje molekularne leków.

Jak odkryto molekularne cele immunomodulacji?

Aby zidentyfikować cele molekularne do immunomodulacji, zespół skonstruował kompleksową sieć transdukcji sygnału odzwierciedlającą biologię TAMs, nałożył na węzły sieci dane RNA-seq z TAMs oraz wykorzystał dane scRNA-seq i cechy topologiczne do wyodrębnienia sieci rdzeniowej zawierającej najbardziej połączone i różnicowo wyrażone geny. Z tej sieci rdzeniowej wybrano listę białek nadających się do dalszych badań.

Do rekonstrukcji modelu biologii TAM badacze zaadaptowali maszynerię szlaku z wcześniej opublikowanej sieci transdukcji sygnału makrofagów do TAMs na podstawie wiedzy z literatury, danych ekspresji genów i baz danych interakcji, uzyskując w pełni połączony graf z 3863 węzłami i 9073 krawędziami. Następnie zintegrowali wyniki różnicowej analizy scRNA-seq porównującej TAMs i makrofagi w stanie ustalonym. Analiza wzoru regulacji 40 najwyżej różnicowo wyrażonych genów wykazała wyraźną regulację w górę białek zapalnych, takich jak IL-1β, NR4A2-3 czy TNFAIP3 w TAMs, co jest zgodne z niemal wyłączną polaryzacją M1 makrofagów pochodzących z mikrośrodowiska guza.

Zakładając, że motywy takie jak pętle sprzężenia zwrotnego i pętle typu feed-forward odgrywają kluczową rolę w (de)regulacji sieci genowych, badacze najpierw wyodrębnili wszystkie 9035 pętli sprzężenia zwrotnego i feed-forward z co najwyżej 4 węzłami z sieci. Następnie obliczyli średnią na wyodrębniony motyw cech topologicznych: stopnia węzła i centralności pośrednictwa węzła, a także cechy ekspresji log2 zmiany krotności. Połączyli te metryki w wynik obliczeniowy i użyli go do wyodrębnienia sieci rdzeniowej zoptymalizowanych według Pareto, najwyżej ocenionych motywów sieci z 77 węzłami i 228 krawędziami. Po odrzuceniu czynników transkrypcyjnych i znanych genów metabolizmu podstawowego, wybrali najbardziej odpowiednich kandydatów do modelowania farmakoforycznego na podstawie stopnia nadekspresji w TAMs, ich znanej roli w stanie zapalnym i ich powiązania z inflammasomem. Dało to 14 kandydatów, którzy wykazywali wyższą ekspresję w grupie komórek TAM.

Aby zidentyfikować najbardziej obiecujące leki oddziałujące z 13 wybranymi kandydatami na białka docelowe, zespół uzyskał ich struktury 3D z publicznych repozytoriów i przygotował modele farmakoforów odpowiednich kieszeni wiążących dla każdego z nich. ZFP36 został odrzucony, ponieważ nie była dostępna struktura 3D. Podczas tych eksperymentów pięć celów (LTA4H_8AVA, HSP90AA1_5J2X, NLRP3_3QF2, PLAUR_1YWH i TANK_1KZZ) nie wiązało się z żadnymi lekami i zostało wykluczonych. Pozostałe osiem celów wykazywało interakcje z ZINC000003830943 i ZINC000003830944. Te dwa związki są składnikami leku joheksol, wodnorozpuszczalnego środka kontrastowego. Tymczasem ZINC000003978028 (antybiotyk klindamycyna) oddziaływał z siedmioma celami. Aby dalej ocenić związki i ich interakcję z celami, oszacowano energie wiązania poprzez dokowanie molekularne. Warto zauważyć, że zarówno klindamycyna, jak i joheksol wykazały interakcje z dwoma w przeciwnym razie niedokowalnymi białkami docelowymi (joheksol z NAMPT, klindamycyna z CASP1), a oba leki wiązały się ze wszystkimi pozostałymi sześcioma celami, gdy wybrano najlepiej zadokowane przypadki. Jednak joheksol nie jest pobierany przez komórki i dlatego jest nieodpowiedni do bezpośredniej modulacji procesów wewnątrzkomórkowych. Tak więc klindamycyna i jej interakcja z kaspazą-1 okazały się najlepszym wyborem do walidacji eksperymentalnej.

Czy klindamycyna blokuje inflammasom i pyroptozę?

Inflammasom, a w szczególności jego składnik NLRP3, został powiązany z progresją nowotworów. Wykorzystując fakt, że NLRP3 jest jednym z aktywatorów kaspazy-1 działających na wyższym poziomie szlaku, zespół zastosował test z nigericyną do oceny wpływu klindamycyny na aktywację inflammasomu NLRP3 w ludzkich makrofagach. Po stymulacji makrofagów pochodzących z monocytów (MDMs) preaktywowanych LPS nigericyną przez 24 godziny zaobserwowano wzrost IL-1β i IL-18 w supernatancie. Dodanie klindamycyny spowodowało znaczne zmniejszenie wydzielania IL-1β i IL-18 indukowanego nigericyną, co sugeruje, że klindamycyna hamuje kanoniczną aktywność inflammasomu.

Aby sprawdzić, czy klindamycyna specyficznie oddziałuje z miejscem aktywnym kaspazy-1, zmierzono aktywację kaspazy-1 w makrofagach traktowanych nigericyną za pomocą odczynnika FLICA®, komórkowo przepuszczalnego, znakowanego fluorescencyjnie inhibitora wiążącego się specyficznie i kowalencyjnie z aktywną kaspazą-1. Cytometria przepływowa wykazała wzrost sygnału fluorescencji pochodzącego z FLICA w makrofagach po stymulacji nigericyną w porównaniu do makrofagów preaktywowanych LPS. Współpodanie klindamycyny prowadziło do zależnego od dawki zmniejszenia fluorescencji (do 2,5-krotnej redukcji), co sugeruje, że klindamycyna konkuruje z FLICA o wiązanie.

Aby określić, czy wiązanie klindamycyny zakłóca aktywację kaspazy-1, monitorowano cięcie kaspazy-1 za pomocą analizy Western blot. Stymulacja nigericyną wywołała cięcie pro-kaspazy-1 do jej aktywnej formy p20, podczas gdy wstępna obróbka klindamycyną zmniejszyła indukowany nigericyną wzrost kaspazy-1 p20 w sposób zależny od dawki. W tych samych lizatach komórkowych nie zaobserwowano żadnych różnic w ilości cząsteczki adaptorowej ASC, która rekrutuje pro-kaspazę-1 do aktywacji. Sugeruje to, że klindamycyna wiąże się z kaspazą-1, blokując jej miejsce aktywne.

Ponieważ stymulacja nigericyną ostatecznie prowadzi do pyroptozy makrofagów, której kaspaza-1 jest kluczowym mediatorem, badacze spekulowali, że klindamycyna może hamować programowaną śmierć pyroptotyczną. Aby to sprawdzić, stymulowali makrofagi nigericyną w obecności lub przy braku klindamycyny i mierzyli uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) do supernatantu po 24 godzinach metodą ELISA. Stymulacja nigericyną spowodowała podwyższony poziom LDH, który został zmniejszony w obecności klindamycyny.

Następnie zbadano cięcie gasderminy D (GSDMD), ponieważ odgrywa ona kluczową rolę w pyroptozie, a proteolityczna aktywacja GSDMD jest głównie pośredniczona przez kaspazę-1. Podczas gdy stymulacja nigericyną prowadziła do zwiększenia ilości rozciętej, aktywnej GSDMD (30 kDa), współleczenie klindamycyną skutkowało znacznym zmniejszeniem produktu cięcia. Ponadto klindamycyna hamowała również aktywację GSDMD przez inne patologiczne induktory stresu, takie jak pozakomórkowy ATP i kryształy moczanu jednosodowego (MSU).

Jakie są kliniczne implikacje modulacji inflammasomu?

Wcześniejsze badania zespołu wykazały, że TAMs od pacjentów ze szpiczakiem mnogim (MM) wykazują nadaktywną oś inflammasom-kaspaza-1, która napędza progresję choroby. Aby przetestować wpływ klindamycyny na tę oś w kontekście choroby, inkubowano biopsje szpiku kostnego (BM) od pacjentów z MM (n = 6) z klindamycyną i ilościowo określono aktywowaną kaspazę-1 za pomocą FLICA metodą cytometrii przepływowej. Podczas gdy nieleczone TAMs (bramkowane jako CD163+/CD15-) wykazywały wysoki poziom aktywowanej kaspazy-1, leczenie klindamycyną prowadziło do znacznego zmniejszenia.

TAMs są prominentnymi infiltrującymi czynnikami immunologicznymi w przerzutach UM do wątroby, a ich obfitość pozytywnie koreluje z niekorzystnym rokowaniem. Biorąc pod uwagę ograniczony sukces obecnych terapii w poprawie wyników u pacjentów z UM z przerzutami do wątroby, badacze postawili hipotezę, że immunomodulacja makrofagów związanych z UM oparta na lekach ma potencjał do przemodelowania mikrośrodowiska guza i, w dłuższej perspektywie, zwiększenia skuteczności interwencji terapeutycznych.

Zaskakująco, status polaryzacji większości makrofagów ze środowiska UM został sklasyfikowany jako M1 w analizowanych danych pojedynczych komórek. Jest to sprzeczne z wcześniejszymi badaniami, które donoszą głównie o polaryzacji M2 w TAMs UM. Jednak badania nad TAM stopniowo odchodzą od uproszczonego modelu polaryzacji M1/M2, a TAMs UM nie są wyjątkiem.

Klindamycyna jest antybiotykiem bakteriostatycznym lub bakteriobójczym, który zakłóca syntezę białek bakteryjnych. Ostatnio antybiotyki zostały zaproponowane jako leki do repozycjonowania w leczeniu raka, a kilka badań klinicznych bada ich skuteczność jako terapii przeciwnowotworowej. Kaspaza-1 uczestniczy w fazie wykonawczej apoptozy i stwierdzono, że potęguje efekt protumorowy TAMs. Odgrywa ona kluczową rolę jako główny efektor w odpowiedzi prozapalnej wywołanej aktywacją inflammasomu. W inflammasomie aktywowany NLRP3 rekrutuje cząsteczkę adaptorową ASC, która wiąże się z pro-kaspazą-1 i wyzwala jej autokatalityczną aktywację. Aktywna kaspaza-1 następnie rozszczepia pro-cytokiny IL-1β i IL-18, aktywując je i przygotowując do uwolnienia. Ponadto aktywacja kaspazy-1 może wyzwalać pyroptozę, programowaną śmierć komórki immunologicznej charakteryzującą się rozerwaniem błony plazmatycznej i uwolnieniem prozapalnej zawartości wewnątrzkomórkowej. Pyroptoza w mikrośrodowisku guza wspiera przewlekłe środowisko zapalne, które wzmacnia transformację komórek nowotworowych i promuje ucieczkę immunologiczną. Co więcej, ostatnie odkrycia donoszą, że blokada sygnalizacji IL-1β indukuje przeprogramowanie TAM i zmniejsza stan zapalny.

Podsumowując, badacze zaproponowali wspomagany siecią potok do repozycjonowania leków, który umożliwia filtrowanie i priorytetyzację interakcji lek-cel. Za pomocą tej metody przewidzieli i zwalidowali nową interakcję lek-cel, która skutecznie blokuje aktywność inflammasomu pośredniczoną przez kaspazę-1 in vitro. Ta nowa interakcja klindamycyny ma potencjał do immunomodulacji TAMs w przerzutowym czerniaku naczyniówki i innych nowotworach, co może przyczynić się do rozwoju nowych strategii terapeutycznych w leczeniu nowotworów.

Podsumowanie

Badania nad czerniakiem naczyniówki, najczęstszym nowotworem złośliwym gałki ocznej u dorosłych, doprowadziły do odkrycia nowej właściwości klindamycyny. Naukowcy, wykorzystując zaawansowane metody obliczeniowe i analizę danych transkryptomicznych, zidentyfikowali interakcję tego antybiotyku z kaspazą-1. Klindamycyna skutecznie hamuje wydzielanie prozapalnych cytokin z makrofagów związanych z guzem oraz blokuje pyroptozę – programowaną śmierć komórek immunologicznych. Badania eksperymentalne potwierdziły, że lek zmniejsza aktywność inflammasomu, co może prowadzić do spowolnienia progresji nowotworu. To odkrycie ma szczególne znaczenie w kontekście przerzutowego czerniaka naczyniówki, gdzie obecne metody terapeutyczne mają ograniczoną skuteczność. Nowa właściwość klindamycyny otwiera możliwości jej wykorzystania w immunomodulacji mikrośrodowiska guza, co może przyczynić się do rozwoju skuteczniejszych strategii leczenia.