Przełom w diagnostyce oporności bakteryjnej: azytromycyna dorównuje erytromycynie

Czy Staphylococcus aureus stwarza nowe wyzwania?

Staphylococcus aureus stanowi istotny patogen odpowiedzialny za szerokie spektrum chorób – od drobnych infekcji skórnych po ciężkie stany ogólnoustrojowe, takie jak zapalenie płuc, bakteriemia czy zapalenie wsierdzia. Rosnąca częstość występowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe wśród szczepów S. aureus stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne, komplikując skuteczne leczenie różnych zakażeń. Częstość występowania metycylinoopornego S. aureus (MRSA) wykazuje zróżnicowanie geograficzne – w Indiach według danych Indian Council of Medical Research wynosi 44,5%, podczas gdy w Nigerii odnotowano 28,7% dla zakażeń pozaszpitalnych i 55,7% dla zakażeń szpitalnych. Klindamycyna, antybiotyk z grupy linkozamidów, jest często stosowana jako alternatywny środek terapeutyczny w zakażeniach gronkowcowych, szczególnie w przypadkach MRSA lub u pacjentów z alergią na antybiotyki β-laktamowe.

Oporność na klindamycynę wśród izolatów S. aureus wykazuje zmienność regionalną, z częstością występowania wynoszącą 26,4% w Indiach, w porównaniu do 68% w São Paulo w Brazylii i 32,7% w wieloośrodkowym badaniu z Chin. Oporność na klindamycynę może występować konstytutywnie lub być indukowalna, co wymaga stosowania dokładnych metod wykrywania fenotypowego w laboratoriach klinicznych. D-test, czyli test dyfuzyjny krążkowy, jest rutynowo stosowany do wykrywania oporności zapośredniczonej przez mechanizm MLSB (makrolidy-linkozamidy-streptograminy B). Test ten pozwala na identyfikację zarówno konstytutywnych (cMLSB), jak i indukowalnych (iMLSB) fenotypów oporności, a także fenotypu MSB (makrolidy-streptograminy B) w izolatach S. aureus.

Ponieważ makrolidy i linkozamidy dzielą wspólne miejsce docelowe w rybosomie, istnieje znaczne ryzyko oporności krzyżowej z powodu modyfikacji miejsca docelowego. Indukowalna oporność na klindamycynę u S. aureus jest głównie zapośredniczona przez geny erytromycynowej metylazy rybosomalnej (erm), takie jak ermA, ermB i ermC. Geny te kodują metylotransferazy, które metylują 23S rRNA podjednostki 50S rybosomu, uniemożliwiając wiązanie makrolidów, linkozamidów i streptogramin B (antybiotyki MLSB). W fenotypie indukowalnym (iMLSB) ekspresja genów erm jest wyzwalana tylko w obecności makrolidów, takich jak erytromycyna, ale nie przez samą klindamycynę. W rezultacie izolaty mogą wydawać się wrażliwe na klindamycynę w rutynowych testach, ale oporność ujawnia się po ekspozycji na makrolidy – stwarzając ryzyko niepowodzenia klinicznego leczenia.

Rozpoznając kliniczne implikacje indukowalnej oporności, Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI) zaleca rutynowe badania przesiewowe w kierunku indukowalnej oporności na klindamycynę (ICR) we wszystkich izolatach S. aureus. ICR odnosi się do zjawiska, w którym izolaty bakteryjne, w tym S. aureus i Streptococcus spp., wykazują pozorną wrażliwość na klindamycynę in vitro, ale mogą rozwinąć oporność po ekspozycji na makrolidy, takie jak erytromycyna czy azytromycyna. Ten indukowalny mechanizm często prowadzi do niepowodzenia terapeutycznego, jeśli klindamycyna jest stosowana bez wcześniejszego wykrycia fenotypu oporności.

Co motywowało do przeprowadzenia badania?

W tym kontekście przeprowadzono badanie mające na celu ocenę częstości występowania indukowalnej oporności na klindamycynę w klinicznych izolatach Staphylococcus aureus. Ponadto celem badania było porównanie skuteczności erytromycyny i azytromycyny jako induktorów oporności na klindamycynę. Azytromycyna została zbadana jako alternatywa dla erytromycyny z powodu okresowych niedoborów krążków z erytromycyną, prawdopodobnie związanych z jej szerokim zastosowaniem w standardowych panelach testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla wielu organizmów (np. Enterococcus). Dodatkowo, szersze zastosowanie kliniczne azytromycyny i malejące wykorzystanie erytromycyny w obecnych warunkach terapeutycznych sugerują, że azytromycyna może lepiej odtwarzać in vitro indukowalne wzorce oporności odzwierciedlające rzeczywiste ekspozycje kliniczne. Istnieje również teoretyczne uzasadnienie, że azytromycyna może służyć jako silniejszy lub bardziej czuły induktor ekspresji metylazy zapośredniczonej przez erm, co uzasadnia jej ocenę w wykrywaniu indukowalnej oporności na klindamycynę.

To przekrojowe badanie porównawcze przeprowadzono w Katedrze Mikrobiologii szpitala trzeciego stopnia referencyjności w Biharze przez okres jednego roku. Uzyskano zgodę Komisji Etyki Badań Klinicznych (numer zatwierdzenia CREC/2025/94). Ponieważ badanie przeprowadzono na anonimowych przechowywanych izolatach bakteryjnych uzyskanych w ramach standardowych procedur diagnostycznych i nie obejmowało bezpośrednio uczestników ludzkich, wymóg zgody pacjenta został uchylony. Wielkość próby obliczono przy użyciu wzoru na pojedynczą proporcję, zakładając oczekiwaną częstość występowania indukowalnej oporności na klindamycynę wśród izolatów Staphylococcus aureus na poziomie 16%, 95% poziom ufności i bezwzględną precyzję 5%, co dało minimalną wymaganą wielkość próby wynoszącą 207 izolatów. Do badania włączono wszystkie niepowtarzalne izolaty S. aureus odzyskane z różnych próbek klinicznych (w malejącej kolejności: wymazy z ropy, aspiraty ropy, mocz i krew) przesłane do laboratorium mikrobiologicznego w okresie badania. Wyłączono izolaty innych gatunków bakterii.

Łącznie 216 niepowtarzalnych izolatów S. aureus zbadano pod kątem indukowalnej oporności na klindamycynę, wykorzystując zarówno erytromycynę, jak i azytromycynę jako potencjalne induktory. Zalecany przez CLSI test D-zone z wykorzystaniem krążków z erytromycyną i klindamycyną służył jako metoda referencyjna. Do oceny oporności na klindamycynę indukowanej azytromycyną zastosowano te same kryteria interpretacyjne, które CLSI M100 definiuje dla oporności indukowanej erytromycyną. Krążki z erytromycyną (15 μg) i azytromycyną (15 μg) umieszczano w odległości 15-26 mm (od krawędzi do krawędzi) od centralnego krążka z klindamycyną (2 μg) na płytkach z agarem Mueller-Hinton (MHA) zaszczepionych badanymi izolatami. Krążki były rozmieszczone tak, że krążek z klindamycyną znajdował się w równej odległości od krążków z erytromycyną i azytromycyną, tworząc linię prostą, jak pokazano na Rysunku 1. Takie umieszczenie zapewniało równomierną ekspozycję trawnika bakteryjnego na oba potencjalne induktory, minimalizując błąd przestrzenny. Aby zmniejszyć błąd obserwatora, wszystkie wyniki testu D-zone były interpretowane niezależnie przez więcej niż dwóch mikrobiologów.

Jakie wyniki ujawnia badanie i jak je interpretować?

Wszystkie krążki antybiotykowe pozyskano od HiMedia Laboratories (Indie). Płytki inkubowano w powietrzu otoczenia w temperaturze 35 ± 2°C przez 16-18 godzin, a średnice stref mierzono zgodnie z wytycznymi CLSI M100. Fenotypowo oporność na klindamycynę zdefiniowano jako: 1. Fenotypy konstytutywnie oporne (cMLSB): izolaty oporne zarówno na erytromycynę (średnica strefy ≤13 mm), jak i klindamycynę (≤14 mm). 2. Fenotypy indukowalnie oporne (iMLSB): izolaty oporne na erytromycynę i wrażliwe lub średnio wrażliwe na klindamycynę (strefa ≥15 mm), z charakterystycznym spłaszczeniem strefy zahamowania klindamycyny przylegającej do krążka z erytromycyną w kształcie litery D, tak że spłaszczenie strefy jest skierowane w stronę krążka z erytromycyną. 3. Fenotyp MS: izolaty oporne na erytromycynę, ale wrażliwe na klindamycynę bez oznak tworzenia strefy D.

Do wprowadzenia wszystkich danych wykorzystano program Microsoft Excel (Microsoft Corp., Redmond, Waszyngton), a do analizy użyto SPSS w wersji 20 (IBM Corp., Armonk, NY). Do analizy opisowej zastosowano częstości i liczebności. Spośród badanych izolatów fenotyp iMLSB (oporność indukowalna) był najczęstszy, obserwowany w 113 izolatach (52,31%), z 100% zgodnością (113/113) między metodą testową a referencyjną. Ta grupa obejmowała 92 MRSA (81,42%) i 21 MSSA (18,58%) izolatów. Fenotyp cMLSB (oporność konstytutywna) wykryto w 26 izolatach (12,03%), obejmujących 21 MRSA i pięć MSSA, ze wskaźnikiem zgodności 100% (26/26). Fenotyp MS (oporny na erytromycynę, wrażliwy na klindamycynę) zidentyfikowano w 37 izolatach (17,13%), ponownie wykazując całkowitą 100% zgodność (37/37) między obiema metodami. Demonstracja tych fenotypów jest pokazana odpowiednio na Rysunkach 2-4.

Dodatkowo 39 izolatów (18,06%) wykazało wrażliwość zarówno na erytromycynę, jak i klindamycynę (jak pokazano wcześniej na Rysunku 1), wszystkie z pełną zgodnością (39/39). Fenotyp L (oporny na klindamycynę, wrażliwy na erytromycynę) zaobserwowano w pojedynczym izolacie (0,46%), który również został konsekwentnie zidentyfikowany przez obie metody (1/1). Ustalenia te wykazują doskonałą zgodność między metodą testową a referencyjną we wszystkich fenotypach oporności na klindamycynę (jak przedstawiono na Rysunku 5). Wszystkie szczepy wrażliwe na erytromycynę były również wrażliwe na azytromycynę. Analiza statystyczna wykazała doskonałą zgodność między metodami testową i referencyjną, z wartością Kappa Cohena wynoszącą 1,0, wskazującą na pełną zgodność. Metryki wydajności, w tym dokładność, czułość i swoistość, wynosiły wszystkie 100%, potwierdzając wiarygodność metody testowej w wykrywaniu indukowalnej oporności na klindamycynę.

W naszym badaniu częstość występowania indukowalnej oporności na klindamycynę, określona za pomocą D-testu, wynosiła 52,31% wśród izolatów S. aureus. Jest to znacznie wyższy odsetek niż wskaźniki raportowane w innych regionach Indii, co podkreśla znaczną zmienność geograficzną. Na przykład badanie przeprowadzone przez Goyala i Singha w Północnych Indiach wykazało znacznie niższą częstość występowania wynoszącą 15,8%, Majhi i wsp. we Wschodnich Indiach zaobserwowali 22% pozytywnych wyników D-testu, podczas gdy Prabhu i wsp. zgłosili 10% częstość występowania. Podobnie Timsina i wsp. zgłosili 23,4% iMLSB w Nepalu. Dodatkowo Majhi i wsp. stwierdzili, że 19,6% izolatów wykazuje fenotyp MS (D-test negatywny), co jest porównywalne z naszym wskaźnikiem 17,13%, oraz 17,7% z konstytutywną opornością MLSB (cMLSB), co przewyższa nasz zaobserwowany wskaźnik 12,03%. Takie różnice mogą odzwierciedlać zmienność w schematach stosowania antybiotyków, praktykach kontroli zakażeń lub mechanizmach oporności specyficznych dla szczepu. Nasze ustalenia dotyczące iMLSB (indukowalnej oporności na klindamycynę) znacznie przewyższają wyniki badań przeprowadzonych przez Majhi i wsp. oraz Saxena i wsp.

Kluczowym ustaleniem naszego badania jest 100% zgodność między erytromycyną a azytromycyną w wykrywaniu indukowalnej oporności na klindamycynę. Wskazuje to, że azytromycyna może być wiarygodnie stosowana zamiast erytromycyny do identyfikacji fenotypów iMLSB. Nasze wyniki są zgodne z wynikami Goyala i Singha oraz Azapa i wsp., którzy również zgłosili pełną zgodność między erytromycyną a azytromycyną w tym celu.

Jakie praktyczne wnioski płyną z otrzymanych danych?

Ostatecznie D-test pozostaje prostym, opłacalnym i niezbędnym narzędziem w mikrobiologii klinicznej do wykrywania indukowalnej oporności na klindamycynę. Nasze wyniki podkreślają znaczenie włączenia tego testu do rutynowych przepływów pracy laboratorium, zwłaszcza biorąc pod uwagę rosnącą globalną częstość występowania oporności na makrolidy. Klinicyści powinni polegać na dokładnych testach wrażliwości, aby kierować terapią i unikać przyczyniania się do rosnącego problemu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Ograniczenia badania jednoośrodkowego mogą ograniczać możliwość uogólnienia wyników na inne regiony lub placówki opieki zdrowotnej o różnych profilach oporności bakterii. Przyszłe badania mogłyby przyjąć projekt wieloośrodkowy z większą i bardziej zróżnicowaną wielkością próby w celu zwiększenia trafności zewnętrznej. Chociaż statystycznie wystarczająca, liczba analizowanych izolatów Staphylococcus aureus mogłaby zostać rozszerzona w przyszłych badaniach w celu wzmocnienia wiarygodności i możliwości zastosowania wyników. Obecna analiza skupiła się wyłącznie na izolatach S. aureus. Włączenie innych klinicznie istotnych organizmów Gram-dodatnich – w szczególności gatunków Streptococcus – zmniejszyłoby błąd selekcji i zapewniłoby bardziej kompleksowe zrozumienie wzorców indukowalnej oporności na klindamycynę w różnych patogenach.

Badanie potwierdza, że azytromycyna jest wiarygodną alternatywą dla erytromycyny w wykrywaniu indukowalnej oporności na klindamycynę u Staphylococcus aureus przy użyciu D-testu, wykazując 100% zgodność we wszystkich fenotypach oporności. Włączenie azytromycyny do rutynowych testów wrażliwości może być szczególnie wartościowe w laboratoriach, gdzie erytromycyna jest niedostępna lub niepraktyczna w użyciu. Jednak konieczne jest ciągłe monitorowanie i większe badania wieloośrodkowe w celu walidacji tych ustaleń w różnych regionach geograficznych i warunkach klinicznych. Dalsze badania powinny również obejmować molekularne potwierdzenie indukowalnej oporności na klindamycynę, obejmujące wykrywanie genów erm – głównie erm(A), erm(B) i erm(C) – przy użyciu metod opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które dostarczają jednoznacznych dowodów na podstawowy mechanizm oporności.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie koncentrowało się na ocenie częstości występowania indukowalnej oporności na klindamycynę w klinicznych izolatach Staphylococcus aureus oraz porównaniu skuteczności erytromycyny i azytromycyny jako induktorów tej oporności. W badaniu przeanalizowano 216 niepowtarzalnych izolatów S. aureus, wykorzystując test D-zone. Wyniki wykazały, że fenotyp iMLSB (oporność indukowalna) był najczęstszy, występując w 52,31% izolatów. Badanie potwierdziło 100% zgodność między erytromycyną a azytromycyną w wykrywaniu indukowalnej oporności na klindamycynę, co wskazuje, że azytromycyna może być skutecznie stosowana jako alternatywa dla erytromycyny w testach diagnostycznych. Częstość występowania oporności była znacznie wyższa niż w innych regionach Indii, podkreślając istotną zmienność geograficzną. Wyniki badania podkreślają znaczenie rutynowego wykonywania D-testu w laboratoriach klinicznych oraz konieczność ostrożnego stosowania antybiotyków w terapii.